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  1. 검체 채취 방법



가. 혈액(Blood)  
 항응고제(Heparin 혹은 EDTA)가 첨가된 혈액을 최소한 5cc 채혈 후 Polypropylen 재질의 플라스틱 튜브에 담아 -20℃ 이하에 냉동보관(유리튜브는 냉동보관 및 운반시 파열의 위험이 있어 사용이 불가능함)

나. 뇌척수액(Cerebrospinal Fluid ; CSF)
 환자의 척추로부터 최소한 4-5cc 정도의 뇌척수액을 가능한 세포보관용 Cryogenic Vial에 담아 -20℃ 이하에 냉동보관(유리튜브는 냉동보관 및 운반시 파열의 위험이 있을 뿐만 아니라 뇌척수액의 단백질이 유리튜브 표면에 부착되므로 사용하면 안됨)

다. PrP Western Blot을 위한 뇌 및 편도선 생검조직(Biopsy Tissues from Brain and Tonsil)
 
환자뇌의 전,측두엽(Frontotemporal Region) 부위에서 Stereotaxic 방법으로 뇌조직 생검을 최소한 200 mg 이상 취득하고 편도 조직의 경우 500 mg 이상을 취득하여 세포보관용 Cryogenic Vial에 담아 -70℃ 이하에 냉동보관

라. 면역조직화학 염색검사를 위한 뇌 생검조직(Biopsy Tissues from Brain)
 
환자뇌의 전측두엽(Frontotemporal Region) 부위에서 최소한 2mm×5mm 크기의 뇌조직 3개 이상을 Stereotaxic 방법으로 취득한후 10% Neutral Formalin속에 고정한후 보관

   2. 실험실 진단 방법



가. 뇌 척수액(CSF)에서 14-3-3 단백질 검출 방법
 환자 뇌척수액(CSF)에서 14-3-3 단백질을 검출하기 위하여 전기영동 장치를 이용한 Western Blot방법을 사용한다. 의뢰된 환자의 뇌척수액(CSF)은 검사하기전까지 -70℃에 보관한다. 뇌 척수액에서  14-3-3 단백질의 검출방법은 환자의 뇌 척수액(CSF)을 5x sample buffer와 혼합한후 5분간 끓인다. 양성 control로는 CJD로 확진된 환자의 CSF에서 14-3-3 단백이 양성으로 검출된 척수액을 위와 동일한 방법으로 처리한다. 그후 양성 control sample과 환자의 sample을 5% stacking gel과 12% separating gel로 만든 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis의 각각 lane에 흘려 넣어준다. 110V로 5시간 전기영동 한후, gel을 60V로 2시간 동안 nitrocellulose membrane (NC membrane)으로 transfer한다. 이후 나온 NC membrane을 1시간정도 5% skim milk와 0.05% Tween 20이 포함된 Tris-buffered saline에 blocking하고 14-3-3β 항체와 반응시킨다. 이어서 0.05%  Tween 20이 포함된 Tris-buffered saline으로 3번 씻어준 후 membrane을 horseradish peroxide-conjugated 된 2차 항체를 이용하여 2시간 반응시킨다. 이후 membrane을 Tween 20이 포함된 Tris-buffered saline으로 3번 씻어준 후 암실에서 Enhanced Chemiluminescence 시약으로 발색한 후 X-ray 필름(Kodak)에 노출하고 현상, 고정하여 30kd 크기의 14-3-3 단백질을 검출한다.

나. CJD 환자의 뇌 및 편도 조직에서 변형프리온 단백 검출 방법
 
진단할 뇌 및 편도 조직의 무게를 재어 100 mg 으로 맞추어 700 ㎕의 5 mM MgCl2 가 포함된 TH (10 mM Tris-HCl, pH 7.5) 완충용액과 조직 무게와 동량의 sea sand를 첨가하여 -70℃에서 10-20분간 두어 얼린 후 녹이면서 vortex를 하여 균질화시킨다. 또는 조직의 양이 적을 경우에는 Sonicator를 이용하여 균질화 시킬 수도 있다.  균질화된 시료에 DNase I 을 40 ㎕/100 mg tissue 가 되게 첨가하여 1시간 37℃에서 반응시키고 다시 조직무게의 두배가 되게 25% Sarkosyl을 첨가한 후 상온에서 30분간 반응시킨다. 그후 상온에서 13,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액을 취해 조직 무게와 동량의 NaCl을 첨가한 후 4℃에 16시간 동안 놓아둔다. 위의 시료를 15,000 rpm으로 4℃에서 40분간 원심 분리하여 생긴 침전물에 TH 완충용액 40 ㎕을 첨가하여 sonication으로 균질화 시킨후, proteinase K (50 ug/ml)로 37℃에서 30분간 처리한다. 그후 2.5배 부피의 에탄올을 첨가하여 13,000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리를 실시한다. 이렇게 얻어진 침전된 PrP fraction을 단백질 전기 영동의 sample buffer를 첨가하여 100℃에서 5분간 끓여 준비한다. 위와 같이 준비된 시료는 15% SDS PAGE로 전기영동하여 nitrocellulose membrane 으로 transfer시킨 후 western blotting을 한다.  PrP 항체는 3F4 (anti-PrP monoclonal antibody)를 그리고 2차 항체로는 horseradish peroxide-conjugated 된 anti-mouse IgG antibody를 이용하여 Enhanced Chemiluminescence 시약으로 검출한다.

다. 프리온 유전자의 염기서열 분석
 
CJD 환자의 프리온 유전자의 염기서열을 분석하기 위해서 환자의 혈액(5ml)을 병원에서 항응고제가 첨가된 Polypropylen 재질의 tube에 채혈한 다음 DNA 분리 Kit를 이용하여 염색체 DNA를 분리한다. 분리한 염색체 DNA에서 특정한 프리온 유전자만 증폭하기 위해서 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행한다. PCR은 DNA 추출물, Primers, 10×reaction buffer, MgCl2, 10mM dNTP, Taq polymerase (Promega)를 혼합한 다음 PCR thermal cycler를 이용하여 수행하는데, 반응 조건은  template를 변성하기 위해서 94oC에서 10분, 그리고 94oC에서 1분, 60oC 에서 1분 30초, 72oC에서 2분 30초 동안 30회를 반응시킨다. 증폭된 PCR product는 1% low melting agarose gel을 굳힌 다음, 전기영동을 100V, 40분간 실시한다. DNA band를 오려 낸 다음 gel elution Kit를 이용하여 elution을 실시한다. Automatic DNA sequencing은 elution된 DNA와 각종 Primer, 5×reaction buffer, V 2.0 Big/Dye terminator를 혼합한 후 PCR을 수행한다. PCR 조건은 96oC에서 10초, 50oC 에서 5초, 60oC에서 4분 동안 25회를 반응시킨 후 에탄올을 가지고 DNA를 침전시킨다. 이 침전된 DNA를 automatic DNA sequencer를 이용하여 1500V에서 7시간 동안 전기 영동을 실시한다. 전기 영동 후  DNA 분석 프로그램을 이용하여 DNA를 분석한다.

라. CJD진단을 위한 조직병리학적 검사
 
생검(biopsy)조직 혹은 부검을 통해 얻은 환자의 뇌조직을 10% buffered formalin 용액이나 4% paraformaldehyde 용액에 담그고 밀봉 후 운반한다. 실험실에 도착된 조직은 생검조직일 경우, 별도의 trimming작업이 없이 dehydration, clearing, paraffin infiltration, embbeding등 일련의 조직처리 과정을 통해 tissue block을 만든다 이때 CJD진단만을 위한 자동 조직처리기를 이용하거나 수 작업으로 수행한다. 그 다음 6 ㎛ 두께로 절편을 만들고 통상적인 Hematoxylin & Eosin 염색과 봉입 후 현미경상에서 신경세포 소실의 결과로서 나타나는 공포(vacuolation)형성에 의한 해면화(spongiform)가 관찰되는 경우나 일부 Bodian plus PAS 염색 혹은 Congo red 염색에서 아밀로이드 플라크가 관찰되는 경우에 GFAP (glia fibrillary acidic protein)과 PrP에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학적 염색을 수행한다. 젤라틴 혹은 Poly-L-lysine 등으로 코팅된 슬라이드 글래스에 조직절편을 붙인다. 다음 xylene용액에서 5분씩 2회 탈파라핀, 100% 70% 에틸알콜 용액에서 각각 3분씩 함수과정을 거쳐 PrPSc검출을 위한 경우에 5-10 ㎍/㎖ proteinase K (PK)를 7분 동안 처리 후 증류수로 수세하고 GFAP염색일 경우는 pK 처리는 생략한다. 0.3 % 과산화수소/methanol에 30분, 증류수와 0.1M Phosphate buffered saline (PBS)으로 각각 5분씩 2회 수세한 후 normal serum으로 1시간 동한 blocking한 다음 1차 항체로 GFAP (anti-GFAP polyclonal) 또는 3F4 (anti-PrP monoclonal)를 적하하고 4℃에서 overnight, 다음 0.1M PBS로 5분간 3회 수세한 후 1차 항체에 대한 biotin이 결합된 2차 항체를 1시간 반응시키고 PBS로 5분간 3회 수세한다. 다음 Avidin-biotin complex용액을 30분 반응 후 PBS로 5분간 3회 수세하고, 0.005% DAB로 발색 관찰하여 성상교세포증 (Astrocytosis)과 PrPSc의 축적을 확인함으로써 조직병리학적인 확진을 내린다.

마. 전자현미경을 위한 SAF 검출
 
전자현미경을 이용하여 Scrapie associated fibrils (SAF)를 전자현미경으로 관찰하기 위해서는 뇌조직이 최소한 500mg-1g이 필요하므로 생검으로는 불가능하고 부검을 시행한 환자에서 가능하다. 검사방법은 환자의 뇌조직을 영하 70℃에 실험전까지 얼려두었다가 0.5-1g의 뇌조직을 Dounce homogenizer에서 A용액(0.32M sucrose, 1mM MgCl2, 0.5mM KCl, 1mM NaHCO3)을 첨가하여 10% 균질화 용액을 만든 후 1,500g로 10분 동안 원심하고 상층액을 덜어둔다. pellet을 15ml A용액을 넣어 vortex mixer로 혼합 후 원심분리한다. 앞의 상층액과 합하여 1,100g 10분 동안 원심분리한다. 다음 17,000g 10분동안 원심으로 상층액에서 crude synaptosomal mitochodria 분획을 얻는다. pellet은 다시 4ml B용액 (0.32M sucrose, 1mM NaHCO3)으로 섞은 후 1ml의 5% octyl glucoside/100mM Tris HCl, pH 7.5를 첨가하면 몇분 후 용액은 투명해지고 gradient (5ml의 1.8M sucrose와 1.4M sucrose/100mM Tris HCl pH7.5)를 형성하고 이것을 Beckman SW27.1 rotar로 85,000g 16시간 원심분리하여 gradient사이를 채취한다. 시료는 4배 내지 10배로 물에 희석하고 1방울을 carbon coated 400mesh copper grid에 1분 동안 투여 한 후 phosphotunstic acid (PTH) pH 7.2 로 1분 동안 염색하고 건조시켜 전자현미경으로 관찰한다. 각 grid에 대해10-20 square 이상 SAF의 유무를 확인하여 prion 감염질환의 확진을 내린다.

   3. TSE 검체물의 포장 및 진단센타로의 전달 방법
 



프리온 질환으로 의심되는 환자의 검체물은 앞에서 기술한 검체 채취 방법에 의거하여 채취한 후 냉동 동결 상태로 보관되는 검체와 고정액(10% Neutral Formalin)에 고정된 상태로 보관되는 검체로 분리한 후 프리온 검체의 포장 운송 규정에 따라 포장하고 환자의 병력, 뇌파소견, CT 혹은 MRI 결과 등을 요약정리한 서류와 같이 진단센터로 전달한다.

가. 냉동보관 검체물 포장방법



냉동보관된 검체(뇌조직, 편도조직, 혈액, 뇌척수액 등)는 Screw cap이 있는 Cryogenic vial에 담은 후에 뚜껑을 단단히 잠그고 cap주위를 비닐 tape등으로 여러번 감싸준 후 액체가 밖으로 흘러나오지 않는지를 확인한다.




일차적으로 검체가 담겨진 Cryogeinc vial을 Screw cap이 있는 2차 용기(Plastic tube)에 다시 담은 후 cap를 단단히 잠그고 뚜껑 부위를 비닐 tape (water proof tape)으로 여러번 감싸준다. 그후 Labeling tape에 검체의 종류와 환자의 성명 및 병원에서 부여된 검체해당 고유번호 등을 기록한후 2차 포장 용기의 표면에 부착한다.


 

2차 포장이 완료되면 가능한 금속재질로 이루어진 3차 포장용기에 넣은 후 2차 용기와 3차 용기 사이에는 수분 흡수력을 충분히 갖춘 흡착가능 물질등으로 채운 후 3차 포장용기를 봉한다.



3차 밀봉된 용기를 스티로폴 재질로 이루어진 box에 담고 주변에 dry ice를 채우고 뚜껑을 닫은 후 비닐 tape로 주위를 단단히 감싸준 후 발송인의 이름, 주소, 전화번호 등을 기록지에 기록후 스티로플 상자표면에 부착한다.



 

Dry ice가 채워진 스티로플 재질의 상자를 다시 종이 box안에 넣은 후 포장을 완료하고 포장 표면에 내용물이 전염성 병원체라는 위험물 표시를 부착한 후 발송인의 주소와 수취인의 주소를 지워지지 않는 유성펜 등으로 기록지에 작성후 box표면에 부착하여 포장을 완료한다.



냉동보관된 검체(뇌조직, 편도조직, 혈액, 뇌척수액 등)는 Screw cap이 있는 Cryogenic vial에 담은 후에 뚜껑을 단단히 잠그고 cap주위를 비닐 tape등으로 여러번 감싸준 후 액체가 밖으로 흘러나오지 않는지를 확인한다.


나. 고정액에 고정된 검체 포장법



 

고정액 (예; 10% Netural Formalin)에 보관된 검체는 검체의 크기에 따라 다양한 크기의 Screw cap이 있는 Polypropylen 재질의 tube에 고정액을 넣고 검체를 넣은 후 tube의 cap를 단단히 잠그고 cap주변을 비닐 재질의 tape로 여러번 감싸준 후 고정액이 흘러 나오지 않는지 확인한다.





고정액과 검체가 들어있는 1차 포장용기가 충분히 들어갈 수 있는 크기의 Screw cap이 있는 2차 Polypropylen 재질의 tube에 넣은 후 다시 cap 주변을 비닐 tape로 밀봉한 후 2차 tube의 표면에 Labeling tape을 이용하여 검체의 종류와 환자의 성명 및 병원에서 부여된 검체 고유번호등을 기록후 2차 tube 표면에 부착한다.



 

2차 포장된 용기를 양철재질로 이루어진 3차 포장용기에 담그고 2차 포장용기와 3차포장 용기 사이에 고정액의 누출시 충분히 흡수할 양의 흡수물질(예; 휴지)로 주위를 잘 채운다. 그후 3차 포장용기 표면에 발송인의 이름, 주소, 전화번호를 기록한다.


 

단단한 재질의 종이로 된 box에 3차 포장용기를 포장한 후 box 표면에 전염성 위험물의 표시와 발송인 및 수취인의 성명, 주소, 전화번호를 기록후 발송한다.

다. 수송방법
 
당일 전달 가능한 지역에서는 직접 센타로 전달되어야하나 불가능한 지역에서는 국내 전지역을 48시간 이내에 전달 체계가 갖추어진 택배회사를 이용하여 진단센타로 발송한다. 이때는 본 전달 용기의 내용물이 전염성 병원체라는 것을 통지한 후 전달과정에서 안전관리에 최선을 다하도록 주지시킨다.


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